Post by account_disabled on Jul 26, 2023 4:37:38 GMT -5
照（图 4E，F）[ 29 ]。相应地，连续免疫荧光和smFISH显示HIF1A-As2和DHX9在细胞核 中共定位（图4G），表明可能存在相互作用。接下来，我们使用HIF1A-As2全长或截短片段进行体外 RNA Pulldown 测定，以绘制与 DHX9 结合的HIF1A-As2功能基序。HIF1A-As2 3' 端的 271 nt 区域被鉴定为必需的D
HX9结合区（图 4H）。为了确认直接相互作用，我们进一步使用过表达 DHX9 全长 (FL) 的构建体、缺乏双链 RNA 结合域 (dsRBDs Del) 的截短 DHX9 构建体或正常肺细胞 BEAS2B 中的空载体（其 HIF1A-As2 表达国家电子邮件列表较低）进行了 CLIP测定。我们观察到HIF1A-As2仅在DHX9 FL的裂解液中富集，但在DHX9 dsRBD Del中不富集，这意味着HIF1A-As2直接与DHX9结合，并且DHX9的dsRBD对于相互作用至
关重要（图 4I）。 图 4：HIF1A-As2直接与 DHX9 相互作用。 图4 H1299 细胞中 UV 交联后，用生物素化反义探针下拉HIF1A-As2，对细胞裂解物进行银染色。用 RNase A 预处理或用管家基因UBC下拉的样品用作阴性对照。黄色箭头表示 DHX9 的条带。B使用质谱法对 HIF1A-As2 Pull-down 细胞裂解物进行分析。质谱 DHX9 肽序列。数据代表两个独立的生物复制。C免疫印迹显示 DHX9 与HIF1A-As2相互